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PCR實驗室入門級別的知識要點

發(fā)表時間:2022/4/7  |  點擊率:1731

一、PCR實驗室的設(shè)計原則
原則上應(yīng)當設(shè)置4個區(qū)域:試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。
根據(jù)使用儀器的功能,區(qū)域可適當合并。
使用實時熒光PCR儀,擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并;
采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀,則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。
各區(qū)功能準備物品清單:
1、試劑儲存和準備區(qū)(1區(qū))
功能:貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的準備,以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。
準備物品:
128-20以下冰箱
2混勻器
3微量加樣器(覆蓋0.2-1000µl
2、標本制備區(qū)(2區(qū))
功能:核酸(RNADNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作,應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護設(shè)備、個人防護和操作規(guī)范的要求。
準備物品:
12-8冰箱、-20-80冰箱
2)高速離心機
3)混勻器
4)水浴箱或加熱模塊
5)微量加樣器(覆蓋0.2-1000µl
6)生物安全柜。
3、擴增區(qū)(3區(qū))
功能:cDNA合成、DNA擴增及檢測。
準備物品:核酸擴增儀(或熒光定量PCR儀)
4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)(4區(qū))
功能:擴增片段的進一步分析測定,如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
準備物品:
1雜交儀、電泳儀、測序儀等
(2)微量加樣器(覆蓋0.2-1000µl)
通用物品:(4個區(qū)都有可能需要)
(1)可移動紫外燈(近工作臺面)
(2)消耗品:一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭
(3)專用工作服和工作鞋(套)
(4)專用辦公用品
(5)樣本管架(2區(qū))
(6)防爆夾(2區(qū))
(7)PCR管架(2區(qū)、傳遞窗)
二、PCR實驗室工作基本原則
1、進入各工作區(qū)域應(yīng)當嚴格按照單一方向進行
試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→ 擴增產(chǎn)物分析區(qū)。
2、各工作區(qū)域必須有明確的標記,不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。
3、不同的工作區(qū)域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開各工作區(qū)域時,不得將工作服帶出。
4、實驗室的清潔應(yīng)當按試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
5、工作結(jié)束后,必須立即對工作區(qū)進行清潔。工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)當可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)當方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵,因此可使用可移動紫外燈(254nm波長),在工作完成后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對(bp),對紫外線損傷不敏感,因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間,最好是照射過夜。
6、實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序,所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。
三、注意事項
1、試劑儲存和準備區(qū)
貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應(yīng)當直接運送至試劑貯存和準備區(qū),不能經(jīng)過擴增檢測區(qū),試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當保存在該區(qū),應(yīng)當保存在標本處理區(qū)。
2、標本制備區(qū)
由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件,避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料,必須在生物安全柜內(nèi)開蓋,并有明確的樣本處理和滅活程序。
3、擴增區(qū)
為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)當盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的是,所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。
4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)
核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣,如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法(放射性核素標記或非放射性核素標記)、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源,因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時,必須使用洗板機洗板,廢液必須收集至1 mol/L HCl中,并且不能在實驗室內(nèi)傾倒,而應(yīng)當至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理,如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,故應(yīng)當注意實驗人員的安全防護。


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